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    五种蛋白质提纯的方法介绍

    提供者:江苏菲亚生物科技有限公司   发布时间:2018/10/16  阅读次数:401次   进入该公司展台

    蛋白质的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛,是一项重要的操作技术。 一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质,一些含量十分丰富,一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质,必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来,本章关于蛋白质的提纯方法只作较简要介绍供广大科研爱好者参阅。

    1、超速离心法

    此法分离和纯化抗原的原理是利用各颗粒在梯度液中沉降速度的不同,使具有不同沉降速度的颗粒处于不同密度梯度层内,达到彼此分离的目的。常用的密度梯度介质有蔗糖、甘油、CsCl等。

    用超速离心或梯度密度离心分离和纯化抗原时,除个别成分外,极难将某一抗原成分分离出来,故只用于少数大分子抗原的分离,如IgM、C1q,甲状腺球蛋白等,以及一些比重较轻的抗原物质如载脂蛋白A、B等。多数的中、小分子量蛋白质采用此种方法很难纯化。

    2、选择性沉淀法

    其原理多根据各蛋白质理化特性的差异,采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀,从而达到纯化的目的。最常用的方法是盐析沉淀法。

    盐析法的原理

    蛋白质在水溶液中的溶解度取决于蛋白质分子表面离子周围的水分子数目,亦即主要是由蛋白质分子外周亲水基团与水形成水化膜的程度以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。蛋白质溶液中加入中性盐后,由于中性盐与水分子的亲和力大于蛋白质,致使蛋白质分子周围的水化层减弱乃至消失。同时,中性盐加入蛋白质溶液后由于离子强度发生改变,蛋白质表面的电荷大量被中和,更加导致蛋白质溶解度降低,使蛋白质分子之间聚集而沉淀。由于各种蛋白质在不同盐浓度中的溶解度不同,不同饱和度的盐溶液沉淀的蛋白质不同,从而使之从其他蛋白分离出来。最常用的盐溶液是33%~50%饱和度的硫酸铵。盐析法简单方便,可用于蛋白质抗原的粗提,丙种球蛋白的提取,蛋白质的浓缩等。盐析法提纯的抗原纯度不高,只适用抗原的初步纯化。

    3、凝胶层析法

    凝胶层析是利用分子筛作用对蛋白质进行分离。凝胶是具有三维空间多孔网状结构的物质,经过适当的溶液平衡后,装入层析柱。一种含有各种分子的样品溶液缓慢地流经凝胶层析柱时,大分子物质不易进入凝胶颗粒的微孔,只能分布于颗粒之间,因此在洗脱时向下移动的速度较快,最先被洗脱。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外,还可以进入凝胶颗粒的微孔中,洗脱时向下移动的速度较慢,随后被洗脱。因此,蛋白质分子按分子大小被分离。

    4、离子交换层析法

    离子交换层析的原理是利用一些带离子基团的纤维素或凝胶,吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。由于各种蛋白质的等电点不同,所带的电荷量不同,与纤维素(或凝胶)结合的能力有差别。当梯度洗脱时,逐步增加流动相的离子强度,使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位置,从而使吸附的蛋白与离子交换剂解离。

    在离子交换色谱技术中常用的离子交换剂有以下几种

    ①具有离子交换基团的纤维素,如羧甲基(CM)纤维素、DEAE-纤维素

    ②具有离子交换基团的交联葡聚糖、琼脂糖和聚丙烯酰胺

    ③凝胶合成的高度交联树脂。

    5、亲和层析

    亲和层析是利用生物大分子的生物特异性,即生物大分子间所具有专一亲和力而设计的层析技术。例如抗原和抗体、酶和酶抑制剂(或配体)、酶蛋白和辅酶、激素和受体、IgG和葡萄球菌蛋白A(SPA)等物质间具有一种特殊的亲和力。例如提纯IgG时,可将SPA吸附在一个惰性的固相基质(如Speharose 2B、4B、6B等)上,并制备成层析柱。当样品流经层析柱时,待分离的IgG可与SPA发生特异性结合,其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后,改变洗脱液的离子强度或pH值,IgG与固相基质上的SPA解离,收集洗脱液便可得到欲纯化的IgG。

    亲和层析法纯化蛋白质抗原的主要优点是纯度高,简单快捷,但成本较贵。

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